Меланотан ® (MTII), синтетический аналог альфа-меланоцитстимулирующего гормона (α-МСГ), использовался для получения загара у людей. Однако вопрос о канцерогенном воздействии местного применения MTII остается открытым. Цель этого исследования — определить противоопухолевую эффективность и механизм действия MTII на модели меланомы B16-F10 in vitro и in vivo. Было обнаружено, что, несмотря на отсутствие влияния на пролиферацию, MTII эффективно подавляет миграцию, инвазию и способность клеток меланомы образовывать колонии. Кроме того, местное применение MTII значительно замедляет прогрессирование опухоли у мышей с уже сформировавшейся меланомой. Гистологический анализ показал, что терапия MTII вызывает апоптоз, подавляя пролиферацию и неоваскуляризацию в тканях меланомы. Иммуноблоттинг и иммуногистохимический анализ показали, что MTII дозозависимо повышает уровень белка фосфатазы и гомолога белка тензина (PTEN) и снижает его фосфорилирование, что приводит к ингибированию сигнального пути AKT/ядерный фактор каппа B (NFκB). Кроме того, MTII подавляет экспрессию циклооксигеназы II (COX-2) и выработку простагландина E2 (PGE2) в клетках меланомы. Наконец, исследования нейтрализации антител показывают, что меланокортиновый рецептор 1 (MC1R) играет ключевую роль в усилении экспрессии PTEN под действием MTII и подавлении развития меланомы. В совокупности эти результаты указывают на то, что MTII вызывает усиление экспрессии PTEN через MC1R, тем самым подавляя прогрессирование меланомы за счет снижения активности сигнального пути COX-2/PGE2. Таким образом, местное применение MTII может стать новой терапевтической стратегией в борьбе с меланомой.
Введение
Меланома — это часто диагностируемый вид рака кожи. По оценкам, в 2018 году в США было зарегистрировано 91 270 новых случаев заболевания [1]. Меланома на ранней стадии обычно поддается лечению с помощью хирургической резекции и лучевой терапии, при этом пятилетняя выживаемость составляет около 90 %. Однако при переходе в злокачественную форму прогноз ухудшается, и пятилетняя выживаемость снижается до 17 %. [2]. Развитие меланомы часто сопровождается несколькими генетическими изменениями, в том числе мутациями N-RAS и BRAF, потерей PTEN, CDKN2A и E-кадгерина [3]. Однако, в отличие от Европы и США, в Азии акральная меланома часто диагностируется с другими генетическими изменениями, вероятно, из-за различий в генетическом фоне и образе жизни [4,5,6]. Таким образом, помимо современных методов лечения, направленных на рецепторные тирозинкиназы (РТК) и мутантный BRAFV600E, для борьбы с меланомой необходимы и другие терапевтические стратегии.
Постоянная активация сигнального каскада фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/киназы AKT является одним из основных факторов, способствующих развитию меланомы. Было показано, что ось PI3K/AKT модулирует несколько важных нижележащих сигнальных путей и факторов транскрипции, в том числе мишень рапамицина в клетках млекопитающих (mTOR), ядерный фактор «каппа-би» (NFκB) и индуцируемый гипоксией фактор 1-альфа (HIF-1α), что в конечном итоге стимулирует ангиогенез и пролиферацию клеток, а также препятствует апоптозу [7]. В оси PI3K/AKT фосфатаза и гомолог тензина (PTEN) играет ключевую каталитическую роль в превращении фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PIP3) в PIP2, тем самым негативно регулируя активацию сигнального пути AKT [8]. Каталитическая активность белка PTEN зависит от фосфорилирования в C2-домене PTEN, включая Ser-380, Thr-382, Thr-383 и Ser-385 [9,10], в то время как стабильность PTEN контролируется убиквитинированием по остаткам Lys-13, Lys-27, Lys-66 и Lys-289 [11,12,13]. Недавние исследования показали, что PTEN не только регулирует репарацию ДНК через сигнальный путь AKT/p38 в цитоплазме [14] но также перемещается в ядро, обеспечивая стабильность хромосом при повреждении ДНК за счет модуляции активности p53 и ингибирования активации ядерного AKT [15,16]. В меланоцитах при воздействии ультрафиолета уровень PTEN повышается за счет передачи сигналов от альфа-меланоцитстимулирующего гормона (α-МСГ) к рецептору меланокортина-1 (MC1R), что снижает окислительный стресс и повреждение ДНК [17].
Циклооксигеназы (ЦОГ) — это семейство миелопероксидаз, расположенных на люминальной стороне эндоплазматического ретикулума и ядерной мембраны. Семейство ЦОГ катализирует лимитирующий этап превращения арахидоновой кислоты в простагландины. Выделяют две изоформы: ЦОГ1 конститутивно экспрессируется в тканях и клетках млекопитающих, а ЦОГ2 редко экспрессируется в большинстве нормальных тканей, но активно индуцируется в ответ на различные раздражители, например при воспалительных реакциях. ЦОГ-2 часто экспрессируется в различных опухолях, в том числе в злокачественных меланомах, и ее уровень коррелирует с неблагоприятным прогнозом и прогрессированием опухоли [18,19]. Простагландин E2 (PGE2) — один из основных продуктов ЦОГ-2, который, как известно, регулирует пролиферацию, апоптоз и подвижность клеток во многих типах опухолей [20]. Совокупность данных свидетельствует о том, что ингибирование циклооксигеназы-2 эффективно подавляет пролиферацию, миграцию и инвазивность клеток меланомы [21,22,23]. Наши предыдущие исследования показали, что доставка гена проопиомеланокортина (ПОМК), предшественника альфа-меланоцитстимулирующего гормона (α-МСГ), эффективно подавляет прогрессирование и метастазирование меланомы за счет ингибирования сигнального пути циклооксигеназы-2/простагландина Е2 [24]. Было установлено, что среди пептидов, полученных из проопиомеланокортина, α-MSH участвует в противоопухолевом механизме генной терапии проопиомеланокортином, подавляя воспаление [24], блокируя неоваскуляризацию [25,26] и повышая чувствительность раковых клеток к апоптозу, вызванному гипоксией [27].
Меланотан ® (MTII) — синтетический циклический гептапептидный аналог противовоспалительного пептида α-MSH. В качестве средства для загара и неселективного агониста меланокортиновых рецепторов (MCR) MTII более эффективен и стабилен, чем эндогенный α-MSH [28]. Интересно, что MTII может быть полезен при лечении эректильной дисфункции, а также нарушений женского возбуждения и оргазма [29]. Однако вопрос о безопасности и онкогенном потенциале MTII остается открытым [30]. Поэтому в данном исследовании мы оцениваем влияние MTII на онкогенное поведение клеток меланомы B16-F10 in vitro. Кроме того, мы выясняем, может ли местное применение MTII остановить прогрессирование меланомы B16-F10 у мышей.
Материалы и методы
Клеточные культуры и реагенты
Клетки меланомы мыши (B16-F10) и человека (A375 и A2058) были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, штат Вирджиния, США). Клетки культивировали в среде DMEM (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния, США), содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Hyclone, Логан, Юта, США), 2 мМ глутамина, 100 мг/мл стрептомицина (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния, США) и 100 ЕД/мл пенициллина при температуре 37 °C в атмосфере с 5 % CO2. Следующие антитела были приобретены в компании Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США): p-PTEN (sc-377573), PTEN (sc-7974), p-AKT (sc-293125), AKT (sc-5298), COX-2 (sc-70879), NFκB p65 (sc8008), MC1R (sc-28990). Антитело против β-актина (A5441) было приобретено в компании Sigma–Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Антитело против Ki67 (MA5-14520) было приобретено в компании Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Антитело против CD31 (NCL-L-CD31-607) было приобретено в компании Leica Biosystems (Ньюкасл-апон-Тайн, Великобритания). Пептид MTII был приобретен в компании Kelowna International Scientific Inc. (Район Сан-Чжун, город Нью-Тайбэй, Тайвань).
Анализ пролиферации клеток
Клетки культивировали в 96-луночном планшете при плотности 1 × 104 клеток/мл. После обработки пептидами MTII в указанной концентрации в течение 48 часов клетки инкубировали с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ; 0,5 мг/мл) в течение 2 часов при 37 °C. Формазан в жизнеспособных клетках растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида и определяли оптическую плотность с помощью микропланшетного ридера (Dynex Technologies, Inc., Шантильи, Вирджиния, США) при длине волны поглощения 570 нм.
Анализ колониеобразования
Клетки B16-F10 в 6-луночных планшетах (1 × 103 клеток на лунку) инкубировали с пептидами указанной концентрации раз в два дня в среде с 5% фетальной телячьей сывороткой в течение 7 дней. В экспериментах по нейтрализации антител клетки одновременно обрабатывали MTII (10 нМ) и антителом к MC1R (2 мкг/мл) раз в два дня в свежей среде с сывороткой в течение недели. После обработки MTII клетки фиксировали в 4% параформальдегиде и инкубировали в растворе кристаллического фиолетового (0,01% в 10% буферном формалине; Sigma–Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 30 минут для подсчета колоний.
Анализ инвазии клеток
Анализ инвазии клеток проводили с помощью камеры Бойдена, как описано ранее [31]. Вкратце: поликарбонатный фильтр (Nucleopore, размер пор 8 мкм; Costar, Кембридж, Массачусетс, США) предварительно покрывали матригелем (разведение 1:2; BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США), после чего подсчитывали количество клеток меланомы B16-F10 в концентрации 3 × 105 клеток/мл в бессывороточной среде DMEM, содержащей указанную концентрацию пептидов. После обработки клеточные смеси в объеме 50 мкл помещали в верхнюю камеру, а в нижнюю камеру добавляли полную среду. Камеру Бойден помещали в увлажненный CO2-инкубатор при температуре 37 °C на 16 часов. Клетки фиксировали в метаноле в течение 10 минут и окрашивали 10-процентным раствором красителя Гимзы (Sigma–Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 20 минут. Количество клеток подсчитывали в трех разных полях зрения при малом увеличении и выражали как среднее значение ± стандартное отклонение.
Тест на миграцию при нанесении царапин
Способность клеток меланомы B16-F10 к миграции оценивали с помощью теста на заживление ран при нанесении царапин. Вкратце, в адгезивном слое конfluent клеток B16-F10 (в шестилуночных планшетах) стерильным наконечником пипетки объемом 0,1 мл (Gilson, Inc., Миддлтон, Висконсин, США) создавали зазор шириной примерно 1 мм. Затем клетки обрабатывали пептидами α-MSH и MTII в концентрации 10−8 М. Степень закрытия бесклеточного промежутка измеряли с помощью микроскопии каждые 2 часа в течение 14 часов.
Модель первичной меланомы
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального университета имени Сунь Ятсена. Для индукции первичной меланомы мышам линии C57BL/6 подкожно вводили клетки B16-F10 в область спины (5 × 105 клеток в 0,1 мл среды). Через 7 дней после имплантации мышей с опухолями случайным образом разделили на контрольную группу и группу с MTII (n = 6). Каждую меланому у мышей ежедневно обрабатывали пептидом MTII (0,1 мл 1 мкг/мл MTII в фосфатно-солевом буфере) в течение 10 дней. Объем опухоли измеряли штангенциркулем по следующей формуле: ширина2 × длина × 0,52.
Иммуногистохимический анализ
Резецированные ткани меланомы были проанализированы на предмет индекса пролиферации, экспрессии PTEN, NFκB и COX-2 с помощью антител Ki67 и соответствующих антител. Вкратце, после депарафинизации резектаты тканей блокировали 3% перекисью водорода в течение 10 минут и извлекали антигенные эпитопы с помощью микроволновой печи в цитратном буфере 10 мМ в течение 30 минут. Указанные антитела наносили на срезы и инкубировали при температуре 4 °C в течение ночи, после чего срезы многократно промывали в фосфатно-солевом буфере. На срезы наносили конъюгат пероксидазы хрена с Fab-фрагментом (система полимерной детекции; Invitrogen/Zymed, Карлсбад, Калифорния, США) и инкубировали в течение 30 минут. Затем срезы инкубировали с субстратом для пероксидазы диаминобензидином (разведение 1:20, Zymed) и окрашивали гематоксилином Гилла, после чего срезы обезвоживали.
Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных срезов опухоли
После депарафинизации и извлечения антигена предметные стекла блокировали раствором, содержащим 5 % бычьего сывороточного альбумина (по объему) и 0,1 % Triton X100 (по объему), на 30 минут и инкубировали с антителом к CD31 при температуре 4 °C в течение ночи. После промывки в фосфатно-солевом буфере срезы инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния, США), в течение 1 часа, затем окрашивали DAPI в течение 10 минут и рассматривали под флуоресцентным микроскопом.
Анализ с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) и мечения концов дУТФ (TUNEL)
Смерть клеток в парафиновых срезах меланомы мышей определяли с помощью ферментативной маркировки разрывов цепей ДНК с помощью анализа TUNEL (набор для определения клеточной смерти In Situ; Roche, Мангейм, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, срезы инкубировали со смесью терминальной трансферазы (TdT) и флуоресцеин-dUTP при температуре 37 °C для мечения свободных 3′-гидроксильных концов геномной ДНК. После окрашивания методом TUNEL срезы контрастировали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом, дигидрохлоридом (DAPI) в течение 20 минут и рассматривали под флуоресцентным микроскопом. Для количественной оценки иммуноокрашивания методом TUNEL каждый образец случайным образом исследовали под микроскопом в трех независимых полях зрения. Процент апоптоза определяли путем нормализации количества клеток, окрашенных с помощью метода TUNEL, по отношению к общему количеству клеток, окрашенных с помощью метода DAPI, и рассчитывали на основе данных из трех независимых полей с увеличением в 100 раз.
Анализ Люциферазы NFkB
Клетки B16-F10 совместно трансфицировали люциферазным вектором, управляемым NFkB (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния, США), и репортерным вектором люциферазы Renilla reniformis (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в соотношении 1:1/10 с использованием реагента Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния, США) в течение 4 ч перед выдерживанием в свежей среде в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали MTII (10 нМ) с добавлением или без добавления репортерной люциферазы. липополисахарид (LPS; 100 нг / мл) в течение 24 часов. Активность люциферазы, управляемой NFkB, в клетках измеряли с использованием набора для двойного освещения (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в микропланшетном люминометре Orion II (Titertek Berthold; Пфорцхайм, Германия) и нормировали с активностью люциферазы R. reniformis в соответствии с инструкциями производителя.
Определение секретируемого PGE2
Концентрацию PGE2 в супернатантах клеточных культур определяли с помощью коммерческого набора для иммуноферментного анализа (Cayman Chemical Company, Анн-Арбор, Мичиган, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, после сбора супернатанта из клеток экстрагировали все клеточные белки и затем определяли их количество с помощью бицинхониновой кислоты (БЦК) для оценки количества клеток в разных группах. Уровень секретируемого PGE2 нормализовали по отношению к общему количеству клеточных белков и выразили в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
Вестерн-блоттинг
Были приготовлены клеточные лизаты, и уровень экспрессии белков измеряли, как описано ранее [32]. Мембрану PVD блокировали 5% молоком в TBS-T в течение 1 часа, затем инкубировали со специфическими первичными антителами и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:10 000 в 5% молоке), в течение 1 часа соответственно. Сигналы на мембране регистрировали с помощью хемилюминесцентного субстрата с пероксидазой хрена (Millipore Corporation; Биллерика, Массачусетс, США) и проявляли рентгеновской пленкой для получения авторадиограммы.
Количественная ПЦР в реальном времени
РНК очищали и проводили количественную ПЦР в реальном времени, как описано ранее [32]. Продукт кДНК использовали для количественной ПЦР в реальном времени с использованием мастер-смеси для ПЦР с красителем SYBR Green и предварительно разработанных наборов зондов и праймеров для гена COX-2 мыши (NM_011198.4). Данные нормализовали по отношению к β-актину (NM_007393.3) и выразили в виде кратных изменений. Последовательности праймеров были следующими: прямой праймер для COX-2 (5′-GGT GTA TCC CCC CAC AGT CA-3′) и обратный праймер (5′-CCA GGC ACC AGA CCA AAG AC-3′); прямой праймер для β-актина (5′-GGA ATC CTG TGG CAT CCA T-3′) и обратный праймер (5′-GCT CAG GAG GAG CAA TGA T-3′).
Статистический анализ
Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (СО). Статистический анализ проводился с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным сравнением по методу Ньюмана — Кейлса или t-критерием (для множественных сравнений) с использованием программы Prism версии 5 (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Значение p менее 0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
MTII эффективно подавляет инвазивность и способность к образованию колоний клеток меланомы B16-F10
Чтобы изучить противоопухолевый потенциал MTII, мы оценили его влияние на пролиферацию, миграцию, инвазию и независимый от прикрепления рост клеток меланомы B16-F10. Несмотря на отсутствие влияния на пролиферацию (рис. 1A), MTII значительно снижал миграцию (рис. 1B,C) и дозозависимо подавлял инвазивность (рис. 1D) клеток меланомы B16-F10. Кроме того, MTII эффективно и дозозависимо подавлял независимый от прикрепления рост клеток меланомы при концентрации всего 0,1 нМ (рис. 1E). Эти результаты позволяют предположить, что MTII подавлял онкогенное поведение клеток меланомы B16-F10, оказывая незначительное влияние на их жизнеспособность.
Влияние MTII на онкогенность клеток меланомы. (A) Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение по результатам трехкратных экспериментов. (B,C) После обработки клеток пептидами MTII и α-MSH в концентрации 10 нМ способность клеток к миграции определяли с помощью теста на заживление ран. Среднее значение ширины щели измеряли в различных экспериментах по дублированию и выражали как среднее значение±SD. (D) После обработки клеток MTII (0,1 нМ–1 мкм) и α-MSH пептидами (10 нМ) соответственно, инвазивную способность клеток определяли с помощью камеры Бойдена с использованием мембраны, покрытой матригелем. Количество пораженных клеток рассчитывали по трем различным полям для каждой экспериментальной группы и выражали как среднее значение±SD. (E) Клетки обрабатывали указанной концентрацией MTII и α-MSH пептидов (10 нМ) соответственно в течение 7 дней. Колонии клеток визуализировали окрашиванием в кристаллический фиолетовый. **: p <0,01.
Местное применение MTII замедляет прогрессирование меланомы у мышей
Затем мы оценили влияние местного применения MTII на рост меланомы B16-F10 у мышей. Было установлено, что 10-дневная терапия MTII значительно замедляет прогрессирование меланомы у мышей: размер опухоли у мышей, получавших MTII, был примерно на 50 % меньше, чем у мышей из контрольной группы (2016,8 против 989,19 мм3; рис. 2A). Иммуногистохимический анализ индекса пролиферации Ki-67 показал, что количество Ki-67-положительных клеток в меланоме, получавшей MTII, было значительно ниже, чем в контрольной группе (рис. 2B). Это сопровождалось значительным увеличением количества TUNEL-положительных апоптотических клеток (рис. 2C, D) и уменьшением количества CD31-положительных неоваскуляризированных микрососудов (рис. 2E, F) в тканях меланомы, обработанных MTII. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что местная терапия MTII эффективно подавляет, но не стимулирует прогрессирование меланомы у мышей за счёт ингибирования пролиферации, индукции апоптоза и блокады неоваскуляризации.
Влияние местного применения MTII на рост опухоли в модели первичной меланомы. (A) Мышам на 0-й день имплантировали клетки меланомы B16-F10. После того как на 10-й день размер опухоли у каждой мыши достиг как минимум 100 мм3, мышей случайным образом разделили на две группы (n = 6) и в течение 14 дней ежедневно наносили на опухоль пептид MTII. Объем опухоли измеряли штангенциркулем раз в два дня и представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Стрелкой указана дата местного лечения препаратом MTII. (B) Репрезентативные изображения экспрессии Ki67 в тканях меланомы из контрольной группы и после лечения препаратом MTII. На гистограмме показан индекс пролиферации ядерно-положительных клеток Ki67 в опухолевых тканях (n = 6 в каждой группе). Масштабная линейка — 200 мкм. (C) Репрезентативные профили окрашивания методом TUNEL в тканях меланомы из контрольной группы и после лечения препаратом MTII. В качестве ядерного контрастного вещества использовался DAPI (синий). Масштабная линейка, 500 мкм. (D) Апоптотические клетки в тканях меланомы выражены в процентах от общего количества клеток, окрашенных с помощью метода TUNEL. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение по результатам 6 экспериментов. (E) Репрезентативные профили окрашивания CD31 в тканях меланомы, обработанных и необработанных MTII. Масштабная линейка, 500 мкм. (F) Количество CD31+ сосудов подсчитывали в различных тканях меланомы (n =6). *: p <0,05, **: p <0,01.
MTII повышал экспрессию PTEN и подавлял сигнальный путь Akt/NFκB в клетках меланомы B16-F10
Поскольку было доказано, что α-MSH стимулирует сигнальный путь PTEN через MC1R в меланоцитах [17], мы решили выяснить, участвует ли повышение экспрессии PTEN в механизме подавления меланомы с помощью MTII. Иммуноблоттинг показал, что MTII значительно и дозозависимо повышал уровень белка PTEN (рис. 3A), но снижал уровень экспрессии неактивного фосфорилированного PTEN (pPTEN; рис. 3B) в клетках меланомы B16-F10. Соответственно, в тканях меланомы B16-F10, обработанных MTII, наблюдалось более интенсивное иммуноокрашивание на PTEN по сравнению с контрольными образцами (рис. 3C).
Влияние пептида MTII на сигнальный путь PTEN/AKT/NFκB в меланоме. (А) После инкубации с пептидом MTII в течение 24 часов клетки собирали и анализировали методом вестерн-блоттинга. Соотношение белков PTEN и β-актина нормализовали с помощью программного обеспечения Image Pro-plus. (Б) Соотношение p-PTEN/PTEN рассчитывали с помощью программного обеспечения Image Pro-plus на основе результатов двух экспериментов. Соотношение белков PTEN и β-актина нормализовали с помощью программного обеспечения Image Pro-plus. Данные представлены в виде кратного изменения ± стандартное отклонение по результатам повторных экспериментов. (C) Иммуногистохимический анализ экспрессии PTEN в тканях меланомы, обработанных MTII, и в контрольных тканях. Масштабная линейка — 200 мкм. Данные были получены на разных образцах тканей меланомы и представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (n = 6). (D) Вестерн-блоттинг-анализ p-AKT, AKT и NFκB (p65) в клетках, обработанных MTII. Для нормализации уровня белка использовался β-актин. (E) Соотношение p-AKT/AKT было рассчитано с помощью программного обеспечения для анализа изображений Image Pro-plus на основе результатов двух экспериментов. (F) Соотношение белков NFκB (p65) и β-актина было нормализовано с помощью программного обеспечения для анализа изображений Image Pro-plus. Данные представлены в виде кратного изменения ± стандартное отклонение по результатам двух экспериментов. (G) Клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими ген NFkB luciferase report, в течение 24 ч, а затем обрабатывали пептидом MTII с LPS или без него еще в течение 24 ч. Активность NFkB измеряли и выражали как среднее значение±SD в трехкратных экспериментах. (H) Анализ экспрессии NFkB p65 по шкале IHC в контрольных тканях меланомы и тканях, обработанных MTII (n = 6). Масштабная линейка, 200 мкм. *: p < 0,05, **: p < 0,01.
Затем мы оценили влияние MTII на экспрессию нижестоящих эффекторов PTEN, в том числе Akt и ядерного фактора каппа-би (NFκB), в клетках меланомы. Иммуноблоттинг показал, что MTII значительно подавляет фосфорилирование Akt и экспрессию NFκB p65 (рис. 3D–F). Последний результат был дополнительно подтвержден с помощью люциферазного анализа, в ходе которого MTII значительно снижал базальную и вызванную липополисахаридом активацию NFκB в клетках меланомы (рис. 3E). Гистологический анализ также показал снижение экспрессии NFκB p65 в тканях меланомы, обработанных MTII, по сравнению с контрольными образцами (рис. 3F). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что MTII усиливает экспрессию PTEN через рецептор MC1R и подавляет сигнальный путь Akt/NFκB в клетках меланомы.
MTII подавляет экспрессию циклооксигеназы-2 и выработку простагландина E2 в клетках меланомы
Поскольку ингибирование сигнального пути NFκB/циклооксигеназы-2 участвует в подавлении меланомы с помощью POMC [24], мы решили выяснить, влияет ли MTII на экспрессию циклооксигеназы-2 и секрецию простагландина E2 (PGE2) в клетках меланомы B16-F10. С помощью вестерн-блоттинга было установлено, что MTII эффективно и дозозависимо снижает экспрессию ЦОГ-2 на уровне мРНК (рис. 4A) и белка (рис. 4B,C) в клетках меланомы. Соответственно, после воздействия пептида MTII в питательной среде клеток меланомы B16-F10 уровень секретируемого простагландина Е2 снижался (рис. 4D). Этот ингибирующий эффект наблюдался и в тканях меланомы, обработанных MTII, по сравнению с контрольной группой (рис. 4E,F). Эти данные свидетельствуют о том, что применение MTII ослабляет передачу сигналов циклооксигеназы-2/простагландина E2 в клетках меланомы.
Влияние пептида MTII на экспрессию ЦОГ-2 и выработку простагландина Е2 в меланоме. (A) Относительную экспрессию мРНК ЦОГ-2 анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение от кратного изменения по сравнению с контролем в двух экспериментах. (B) Вестерн-блоттинг для анализа экспрессии ЦОГ-2 в клетках меланомы B16-F10, обработанных MTII. (C) На гистограмме показано соотношение белков в двух экспериментах. Данные выражены в виде кратных изменений ±SD. (D) Уровни секретируемого белка PGE2 (пг/мл) определяли с помощью набора для анализа ELISA в трехкратных экспериментах. (E) Репрезентативные профили экспрессии COX-2 и PGE2 в контрольных тканях меланомы и тканях, обработанных MTII. Шкала, 200 мкм. (F) Значение полукокса было рассчитано и выражено как среднее значение±SD по результатам шести экспериментов. *: p < 0,05, **: p < 0,01.
Нейтрализация MC1R антителами устраняет подавление меланомы, вызванное MTII
Чтобы выяснить, подавление меланомы, вызванное MTII, происходит за счет сигнального пути, опосредованного MC1R, мы использовали нейтрализацию антителами для блокирования взаимодействия между MTII и MC1R в клетках меланомы B16-F10. Вестерн-блоттинг показал, что нейтрализация MC1R антителами значительно ослабляла вызванное MTII снижение фосфорилирования PTEN/AKT (рис. 5A–C). Аналогичным образом сниженная выработка PGE2 под действием MTII восстанавливалась при использовании антител к MC1R (рис. 5D). Наконец, с помощью анализа колониеобразования было показано, что нейтрализация антител к MC1R ослабляет опосредованное MTII ингибирование независимого от прикрепления роста клеток меланомы (рис. 5E, F). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что MC1R участвует в механизме, лежащем в основе опосредованной MTII активации PTEN и ингибирования AKT/COX-2.
Влияние нейтрализации антител к рецептору меланокортина 1 на вызванное MTII ингибирование фосфорилирования PTEN и образование колоний. (A) Вестерн-блоттинг-анализ экспрессии PTEN и AKT в клетках, инкубированных с пептидом MTII и антителом к рецептору меланокортина 1. Для нормализации уровня белка использовался β-актин. (B,C) На гистограмме показано соотношение белков в двух экспериментах. Данные выражены в виде кратных изменений ± SD. (D) Уровни секретируемого белка PGE2 (пг/мл) были определены с помощью набора для анализа ELISA в трехкратных экспериментах. (E) Репрезентативные изображения окрашивания кристаллическим фиолетовым в клетках, получавших антитела к пептиду MTII и MC1R, по сравнению с контрольной группой. (F) Количество клеточных колоний рассчитывали по результатам различных экспериментов с трипликацией и выражали как среднее значение±SD. *: p <0,05, **: p <0,01; ns, значимости нет
Обсуждение
Несмотря на развитие медицинских технологий, злокачественная меланома по-прежнему остается одним из самых трудноизлечимых видов рака. Настоящее исследование впервые доказывает, что местное применение средства для загара MTII подавляет, а не стимулирует развитие уже сформировавшейся меланомы в доклинической модели. Кроме того, применение MTII оказывает противомеланомное действие за счет множества клеточных механизмов, включая ингибирование пролиферации, индукцию апоптоза и блокирование неоваскуляризации. Таким образом, наше исследование не подтверждает мнение о том, что средство для загара MTII повышает риск развития меланомы [30]. Хотя точный механизм влияния на стабильность и посттрансляционную модификацию (фосфорилирование, убиквитинирование и т. д.) белка PTEN еще предстоит выяснить, мы предлагаем следующую рабочую модель влияния MTII на подавление развития меланомы (рис. 6). После связывания с MC1R MTII вызывает реактивацию PTEN и репрессию AKT, тем самым подавляя передачу сигналов NFkB/COX-2/PGE2 ниже по течению, что приводит к подавлению меланомы.
Рабочая модель подавления меланомы с помощью MTII за счет повышения уровня PTEN и ингибирования COX-2/PGE2. После связывания с MC1R MTII повышает уровень PTEN в клетках, подавляя пути деградации PTEN, такие как фосфорилирование и убиквитинирование. В результате повышенная экспрессия PTEN препятствует активации AKT и экспрессии COX-2, опосредованной NFκB, а также высвобождению PGE2.
Настоящее исследование демонстрирует эффективность MTII в подавлении онкогенности клеток меланомы B16-F10 in vitro и in vivo. Этот результат согласуется с результатами предыдущих исследований, в которых применялась генная терапия с использованием гена проопиомеланокортина или α-MSH [25,32,33,34]. Кроме того, у животных, получавших местное лечение с применением MTII, не наблюдалось явных изменений в активности, аппетите и массе тела (данные не представлены), что свидетельствует о хорошей переносимости местной терапии с применением MTII мышами с меланомой. Эти результаты убедительно доказывают, что местная терапия с применением MTII может быть эффективна в борьбе с меланомой. Однако у этого исследования есть некоторые ограничения. Во-первых, в эксперименте на животных была использована всего одна доза MTII (0,1 мкг в день на опухоль в течение 10 дней), поэтому не удалось определить ни минимально эффективную концентрацию, ни максимально переносимую дозу для местного применения MTII. Во-вторых, для местного применения MTII использовалась формула на основе солевого раствора, которая далека от идеала с точки зрения стабильности, абсорбции и проникновения препарата. В-третьих, несмотря на то, что мышиная модель меланомы B16-10 является отличной и популярной, она может не в полной мере воспроизводить генетические особенности меланомы человека. Наконец, в этом исследовании не рассматривался вопрос о том, влияет ли MTII на возникновение меланомы. Для устранения этого недостатка необходимы дальнейшие эксперименты.
PTEN — это фосфатаза, которая негативно регулирует сигнальные каскады PI3K/AKT. После мутации или потери гена PTEN постоянная активация оси PI3K/AKT делает опухолевые клетки более агрессивными и ускоряет прогрессирование опухоли [35]. Настоящее исследование показало, что обработка MTII повышает уровень белка PTEN и снижает долю фосфорилированного PTEN в клетках меланомы B16-F10. Кроме того, блокады поверхностного MC1R путем нейтрализации антителами было достаточно, чтобы отменить индуцированную MTII регуляцию PTEN и ингибирование роста, независимого от закрепления. Такая MC1R-опосредованная активация PTEN, по-видимому, согласуется с предыдущим исследованием Cao et al. [17], которое показало, что PTEN может рекрутироваться в MC1R и защищаться от убиквитинирования после воздействия UVB на меланоциты. Интересно, что α-MSH вызывает повышение внутриклеточной концентрации цАМФ в клетках меланомы человека с рецептором MC1R дикого типа, но не в клетках меланомы с мутантным рецептором MC1R [36,37]. Таким образом, эти результаты убедительно подтверждают нашу гипотезу о том, что передача сигналов через рецептор меланокортина 1-го типа и цАМФ играет доминирующую роль в подавлении развития меланомы, вызванном меланоцитарным трансформирующим фактором 2-го типа. Однако мы не можем исключить возможное участие рецепторов меланокортина 4-го и 5-го типов, которые также присутствуют в клетках меланомы B16-F10. В настоящее время точный механизм, с помощью которого меланоцитарный трансформирующий фактор 2-го типа повышает стабильность PTEN, остается неясным. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, регулирует ли MTII экспрессию или активность src/казеинкиназы 2 или убиквитинлигаз (таких как WWP1 и WWP2), тем самым модулируя экспрессию PTEN в клетках меланомы [11,13,35].
Хроническое воспаление является ключевым фактором прогрессирования опухолей [38]. Наше предыдущее исследование показало, что ингибирование воспалительной сигнальной системы циклооксигеназы-2/простагландина Е2 способствовало подавлению меланомы с помощью полимолочной кислоты in vitro и in vivo [24]. Это согласуется с результатами настоящего исследования, которое показало, что MTII замедляет прогрессирование меланомы за счет снижения экспрессии циклооксигеназы-2 и уменьшения уровня простагландина Е2 в наномолярном диапазоне в клетках меланомы B16-F10, а также в тканях меланомы. Недавно была выявлена положительная корреляция между экспрессией COX-2 и PD-L1 при первичной и метастатической меланоме [39]. Кроме того, применение ингибитора ЦОГ-2 целекоксиба способно снижать уровни белка PD-L1 в клеточных линиях меланомы человека. Следовательно, модулирующая ЦОГ-2 функция MTII подразумевает его потенциал в качестве адъюванта в комбинации с терапией иммунных контрольных точек против PDL1 для контроля прогрессирующей меланомы.
Таким образом, MTII оказывает противоопухолевое действие в отношении меланомы in vitro и in vivo. Противоопухолевый механизм MTII заключается в активации сигнального пути MC1R/PTEN и последующем ингибировании онкогенной оси AKT/NFκB/COX-2. Следовательно, MTII может стать новым терапевтическим средством для борьбы со злокачественной меланомой.
Авторский вклад
Дж.-К. В. и Х.-Э. Т. разработали план экспериментов и подготовили иллюстрации; Ю.-Х. Х. и Дж.-С. В. провели эксперименты; Дж.-К. В., К.-С. В. и М.-Х. Т. написали и отредактировали рукопись. Все авторы ознакомились с опубликованной версией рукописи и согласны с ней.
Цзянь-Цзин Ву 32,1,, Хан-Эн Цай 4, И-Сян Сяо 4, Цзи-Сюань Ву 4, Чие-Шань Ву *6,5,, Мин-Хун Тай 2,3,4,7,*